Abstract

DO.02.07

Vergleichende in-vitro-Toxizitätsanalyse von Konservierungsstoffen an primären und immortalisierten Keratozyten

Kagan L., Rieck P.
Augenklinik, Campus Virchow Klinikum, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Ziel: Immortalisierte Zellreihen nehmen in der Forschung zunehmend einen wichtigen Platz ein. In dieser Studie wurden humane primäre (HCKp) und immortalisierte Keratozyten (HCKi) auf ihr Proliferations- und Toxizitätsverhalten untersucht, um eine Aussage über den Einsatz immortalisierter Keratozyten als Ersatz für primäre Zellen zu machen.
Methode: HCKp und HCKi wurden kultiviert, mit den Konservierungsstoffen Cetrimid bzw. Benzalkoniumchlorid (BAC) in verschiedenen Konzentrationen (100-0,01microg/ml bzw. 40-0,1 microg/ml) versetzt und 72 Stunden inkubiert. Eine qualitative und quantitative Auswertung der Zellen erfolgte unter dem Mikroskop bzw. mit einem Zellcounter, wobei auch die Verdopplungszeit berücksichtigt wurde. Der Anteil apoptotischer Keratozyten wurde mittels TUNEL-Assay und eines Annexin-V-Propidiumiodid-Kits bestimmt.
Ergebnisse: Bei Behandlung mit BAC waren in den Konzentrationen 40-4 microg/ml sowie bei Cetrimid 100-10 microg/ml keine vitalen Zellen mehr nachweisbar. Ab <0,4 microg/ml wurde bei den mit BAC behandelten HCKi im Gegensatz zu HCKp ein im Vergleich zur Kontrolle signifikanter Anstieg der Zellzahl gezeigt. Unter Cetrimid zeigten HCKi einen hochsignifikanten Abfall der Zellzahl, wobei im Gegensatz zu HCKp bereits ab einer Konzentration von <0,1microg/ml kein statistischer Unterschied im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Bei Auswertung der Verdopplungszeit zeigten sich deutlich kürzere Zeiten bei HCKi. Außerdem scheint BAC in geringen Mengen proliferativ zu wirken, da die Verdopplungszeit sich bei HCKp tendenziell, bei HCKi signifikant verkürzte. Cetrimid führte hingegen zu einer signifikanten Verlängerung der Verdopplungszeit bei HCKp bis 0,1 microg/ml, bei HCKi bis 1microg/ml.
Schlussfolgerungen: Immortalisierte Keratozyten sind insbesondere für Vorversuche zur Festlegung von toxischen Konzentrationen geeignet. Es zeigten sich aber auch deutliche Unterschiede zwischen beiden Zellreihen, sowohl im Proliferationsverhalten als auch in ihrer Sensitivität auf toxische Agentien. Im Gegensatz zu HCKp weisen HCKi eine stärkere Widerstandsfähigkeit und eine höhere Regenerationsfähigkeit auf.

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