Abstract

DO.24.07

Quantifizierung von vitalen und geschädigten retinalen Ganglienzellen im Netzhautflachpräparat – ein Methodenvergleich

Lasseck J., Grieshaber P., Lagrèze W.
Universitäts-Augenklinik Freiburg

Ziel: Die Quantifizierung retinaler Ganglienzellen (RGZ) ist eine grundlegende Methode in der Bearbeitung neuroprotektiver Fragestellungen; so kann mittels der Zellzahl untersucht werden, ob ein Medikament geschädigte RGZ vor dem Zelltod bewahrt. Der Goldstandard im Tiermodell ist das retrograde Färben (RF). Ein Fluoreszenzfarbstoff wird retrograd über axoplasmatischen Fluss in den Zellkörper transportiert. Diese Methode ist hoch spezifisch, erfordert aber eine Operation, verlängert den Versuchsablauf um eine Woche und erlaubt keine Aussage über die Vitalität der Zelle (eine gefärbte aber tote Zelle entgeht erst nach Phagozytose durch Mikroglia der Auswertung). Wir suchten eine alternative Methode zur Quantifizierung vitaler RGZ am retinalen Flachpräparat und korrelierten das RF mit einer Vitalitätsfärbung durch Calcein.
Methode: An Ratten erfolgte die stereotaktische Injektion von Fluorogold (FG) auf Höhe der Colliculi superiores. Nach 6 Tagen erfolgte eine einseitige Sehnervquetschung links. Das jeweils rechte Auge diente als Kontrolle. 5 Tage später erfolgte die Explantation der Netzhaut (NH). Nach Erstellung von Flachpräparaten und Glaskörperentfernung wurden die NH für eine Stunde mit Calcein in Kulturmedium inkubiert. Nach Eindeckeln erfolgte die sofortige Auswertung einer definierten Fläche in allen NH-Exzentrizitäten. Ermittelt wurden Mittelwert und Standardabweichung pro mm².
Ergebnisse: In den Kontroll-NH (n=3) färbten sich in 31 ausgewerteten Feldern 1881±461 Zellen/mm² FG positiv (⁺), 1828+/-444 Zellen/mm² Calcein⁺ und 1573±355 Zellen/mm² (83,7%) doppelt positiv. In den NH nach Sehnervquetschung (n=4) färbten sich in 42 ausgewerteten Feldern 1482±569 Zellen/mm² FG⁺, 1303±438 Zellen/mm² Calcein⁺ und 893±334 Zellen/mm² (60,3%) doppelt positiv.
Schlussfolgerungen: FG⁺/Calcein negative (^-) Zellen sind möglicherweise funktionslose RGZ mit erhaltener Morphologie vor Phagozytose. FG^-/Calcein⁺ Zellen sind keine RGZ. Die zusätzliche Calcein-Färbung ermöglicht die Identifizierung lebender RGZ. Dies erhöht die Zuverlässigkeit der Bewertung neuroprotektiver Substanzen.

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